Labgoritmus

Clostridium difficile.

Como ustedes saben, me encantan los temas que están colgando en la rutina sin ser prácticos o  sin claridad. Me gusta tomarlos en la mano y escudriñarlos un poco para ver cómo mejorarlos. En esta ocasión quiero hablarles de un tema que me está llamando la atención desde hace varios años y es el de las enfermedades gastrointestinales asociadas a desequilibrios de la microbiota, hoy vamos a hablar específicamente del Clostridium difficile.

Para este texto me base en dos artículos, uno que detalla la infección como tal (1) y otro que describe las pruebas diagnósticas que se ofrecen y su utilidad (2).

Sobre la enfermedad.

En el reino de las bacterias, existe un grupo de más de 300 variedades de un genus Clostridium difficile (C. difficile). Esta es una bacteria clasificada clínicamente como fastidiosa debido a sus altos requerimientos nutricionales para poder ser cultivada. Colorea positivamente en la tinción de Gram y tiene la facultad de formar esporas. Este grupo de bacterias tiene la capacidad de colonizar con facilidad microambientes en tracto gastrointestinal, especialmente en el intestino grueso de mamíferos al encontrar desequilibrios en la microbiota y expandir su acción en dicho órgano (3).

Existen cepas de toxigénicas y no toxigénicas. Las cepas toxigénicas tienen la capacidad de afectar las células del epitelio intestinal gracias a un grupo de toxinas que libera y que ayuda a expandirse. Las principales toxinas son la toxina A (TcdA) y la toxina B (TdcB) (4), está última presente en todas las cepas toxigénicas y de mayor actividad; estas están en compañía de dos genes de regulación (TcdC y TcdD) en donde el gen TcdD regula positivamente la liberación de toxinas A y B y el TcdC controla negativamente dicha liberación. Una mutación en el gen TcdC imposibilita la regulación negativa de la liberación y hace que la cepa produzca una mayor cantidad de toxina. 

La acción de esta toxina en las células está relacionada con el daño del citoesqueleto generando la muerte de la misma, esto conlleva un proceso inflamatorio que se prolifera en daño tisular y el cuadro clínico de diarrea. Existe una tercera toxinas llamada toxina binaria la cual incrementa el nivel de virulencia de la bacteria que afecta de igual manera el citoesqueleto de la célula generando proyecciones de microtúbulos que hacen que la bacteria se adhiera a la célula y sea difícil controlar su diseminación (5). 

Desequilibrio en la Microbiota.

Tengamos presente que nuestro intestino tiene una microbiota que incluye hasta 4 000 diversos microorganismos y que en equilibrio con nuestro sistema inmune mantienen el microambiente ideal y así obtienen beneficios simbióticos entre nosotros y ellos. La llegada de este tipo de bacterias en un ambiente que haya sufrido un desequilibrio en esta relación encuentra un ambiente propicio para proliferar y afectar la salud (6).

De esta manera encontramos una bacteria que propicia su supervivencia al barrer la microbiota intestinal debido a la acción de sus toxinas. Según la epidemiología de la enfermedad, se ha he definido que las personas con mayor riesgo de contraer la infección son personas inmunocomprometidas usualmente pacientes mayores de 65 años, pacientes con periodos prolongados de hospitalización y pacientes que estén bajo tratamientos prolongados con antibióticos, que generan como consecuencia un agotamiento de la microbiota intestinal pedido a la acción de los mismos medicamentos. Una definición Europea dice “un cuadro clínico compatible con CDI (Infección por C. difficile) y evidencia microbiológica de que la toxina A y/o la toxina B que producen C. difficile en las heces sin evidencia de otra causa de diarrea o paciente con PMC (colitis pseudomembranosa)” (7)

Encontramos entonces manifestaciones clínicas con un amplio abanico de presentaciones que van desde los portadores asintomáticos hasta procesos inflamatorios severos en el colon. Es de considerar que cualquier caso que cumpla con alguna de estas características poblacionales con un cuadro clínico de diarrea con más de 3 deposiciones al día y dolor abdominal, es candidato de sospecha de colitis pseudomembranosa por C. difficile. Algunas condiciones adicionales se pueden considerar de mal pronóstico como es el caso de pacientes inmunocomprometidos, presencia de enfermedad renal, leucocitosis (>15.000 cel/mm) hipoalbuminemia (< 3g/dL) y la presencia de enfermedad inflamatoria intestinal (8).

Si tenemos en cuenta esos factores de riesgo, no es difícil pensar que en clínicas y hospitales la generación de brotes por ese tipo de microorganismos es muy usual. Lo normal es que el paciente se aísle y se le brinde un manejo especial para evitar la diseminación en otros pacientes. Pero es evidente que el diagnóstico es clave para identificar el riesgo en la salud de la persona. 

Es por esto que en este capítulo quiero aclarar aspectos importantes a tener en cuenta a la hora de generar un correcto diagnóstico de la enfermedad por los laboratorios clínicos. 

El diagnostico.

Comencemos con el tipo de muestra. Al intentar detectar a la gente causal o sus toxinas está claro que la muestra debe ser heces. Considerando la sospecha de la enfermedad lo usual sería encontrarnos con muestras de aspecto líquido o sin consistencia. Bajo estas condiciones cada clínica u hospital debería considerar crear unas políticas de rechazo de muestras, ya que si se procesan muestras de pacientes que no cumplan con estas características es probable que diagnostique portadores asintomáticos.

Las muestras en hisopados pueden ser útiles para pruebas como los cultivos o pruebas moleculares, pero no resultan útiles para pruebas de citotoxicidad o inmunoensayos enzimáticos. La conservación más estandarizada en diversas pruebas es que las muestras sean refrigeradas a 4 grados centígrados por 3 días como máximo; en caso de extender el límite de tiempo recomendado, es preferible congelar la muestra. La estabilidad puede variar según el método utilizado y es recomendable limitarse a lo sugerido por el proveedor de la prueba a realizar. (9)

Las pruebas usadas para el diagnóstico de C. difficile se pueden clasificar según el objetivo de detección:

Prueba	Objetivo	Interpretación	Ventaja	Desventaja
Ensayo Citotoxicidad en heces (CTA),	Toxinas Libres en heces	Infección por Clostridium difficile	Alta especificidad	Largos tiempos de respuesta, compleja estandarización
Inmunoensayo enzimático para Toxina A y B	Toxinas Libres en heces	Infección por Clostridium difficile	Rapidez	Baja sensibilidad (50 – 80%)
Inmunoensayo enzimático para Glutamato deshidrogenasa	Presencia de Clostridium difficile en heces	Cepa toxigénica o no	Alto valor predictivo negativo (en ausencia de brotes)	Baja especificidad
Cultivo	Presencia de Clostridium difficile en heces	Cepa toxigénica o no	Alta sensibilidad en identificación, posibilidad de pruebas de sensibilidad	Baja especificidad
Cultivo toxigénico	Presencia de una cepa toxigénica	Infección por Clostridium difficile o portador de cepa toxigénica	Alta sensibilidad	Baja especificidad y largos tiempos de respuesta
NAAT (Biología molecular)	Presencia de una cepa toxigénica	Infección por Clostridium difficile o portador de cepa toxigénica	Alto valor predictivo negativo, rapidez	Baja especificidad y altos costos

A continuación explicaré algunos detalles de las pruebas anteriormente mencionadas.

Prueba de citotoxicidad en heces. 

En esta prueba, el laboratorio realiza un ensayo en donde la muestra fecal es filtrada y se aplica en cultivos celulares para observar efectos citopáticos característica de la fisiopatología de la infección (células en forma redonda). Este proceso puede tardar hasta 2 días incubando las células a 36 grados centígrados. 

Esta prueba presenta excelentes resultados de sensibilidad (11). El principal problema con esta técnica es la dificultad en estandarizar el método y el factor tiempo, ya que los resultados se obtienen de 24 a 48 horas. Es una prueba que puede ser a bajo costo pero se dificulta mucho en implementación y efectividad debido a que no está bien estandarizada en cuanto al tipo de células, diluciones de la muestra y periodos de incubación (2).

Inmunoensayos enzimáticos para detección de Toxina A y B. 

Respecto a las pruebas de inmunoensayo enzimático que detectan TcdA y TcdB, encontramos que los proveedores prometen rendimientos muy superiores a los que algunos estudios han demostrado. Cuando se inspecciona los instructivos de uso y desempeño de los proveedores se encuentra que la sensibilidad promedio está cercana al 95% en la mayoría, sin embargo, según un meta análisis comparativo (12), se evidencia que según el tipo de prueba con la que se compara, sus niveles de sensibilidad y especificidad varían, se demuestra que son técnicas que comparadas con cultivos toxigénicos pueden tener una sensibilidad que difícilmente alcanza el 65% en algunas técnicas; comparados con otras técnicas como las CTA aumentan la sensibilidad a un 85%. La verdadera fortaleza de estas técnicas es su especificidad, ya que al detectar TcdA y/o TcdB, si se comparan con las pruebas de referencia obtienen resultados por encima del 90% de especificidad.

Glutamato Deshidrogenasa.

Una prueba que tiene una mayor sensibilidad y que puesta en un protocolo de diagnóstico bien complementado muestra grandes beneficios es la prueba de inmunoensayo enzimático para la detección de glutamato deshidrogenasa (GDH), esta es una enzima producida por todas las cepas de C. difficile y puede ser detectada por métodos inmunocromatográficos o por inmunoensayos del tipo ELISA (Enzime Linked Immunosorbent Assay). Poseen un alto valor predictivo negativo (descarta de forma eficiente la enfermedad). Sin embargo, esta prueba debe ser usada con cautela en condiciones de aumento de prevalencia o brotes, debido a que su alto valor predictivo negativo puede ser contraproducente bajo estas condiciones. Esta prueba debe ser usada en conjunto con una prueba como las de detección de toxinas(13) .

Cultivos.

Ahora pasemos a hablar de los cultivos, se usan medios selectivos usualmente compuestos por agar cicloserina cefoxitina fructosa. Algunos otros mejorados se agregan al caldo taurocolato de sodio para potenciar la germinación bacteriana. También se encuentran en el mercado medios cromogénicos capaces de diferenciar y reducir los tiempos de incubación del mismo a 24 horas(14). Todos estos medios deben ser incubados en ambientes de anaerobiosis durante al menos 48 horas a 36 grados centígrados.

Luego de obtenido el crecimiento bacteriano, se pasa a realizar pruebas de identificación, para lo cual existen diversos métodos como por ejemplo tiras de galería, cromatografía gas-líquido, aglutinación de látex para GDH o espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF). Posterior a su identificación se realizan pruebas de producción de toxinas. Debido a la cantidad de procesos para realizar de esta manera, queda claro que los medios de cultivo son una opción dispendiosa, sin embargo, es considerada la prueba de referencia incluso para pruebas moleculares. Es muy usada en caso de estudios epidemiológicos de brotes y control de enfermedades infecciosas(2).

Pruebas de ácidos nucleicos.

Las pruebas moleculares o pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (Nucleic Acid Amplification Testing, NAAT), se fundamentan en el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en el cual se logra identificar una secuencia específica del genoma del objetivo, en este caso, el de la bacteria de Clostridium difficile, con sus genes para toxinas TcdA y TcdB, adicionalmente posibles mutaciones de los genes de regulación de expresión de las toxinas para identificar virulencia de la cepa. Este método es de alta sensibilidad y logra determinar en corto tiempo la ausencia del agente causal gracias a su tecnología. Esta técnica presenta una gran variedad de opciones de plataformas de procesamiento, que entregan productos para todas las necesidades, desde laboratorios de bajo volumen, hasta puntos masivos de procesamiento. Algunos productos pueden detectar una sola secuencia específica de alguno de los genes, otros proveedores incluyen la detección de múltiples secuencias, lo que mejora más el desempeño de la prueba. Existen algunos parámetros para tener en cuenta con el uso de esta prueba, el costo de la prueba es el principal problema, ya que son técnicas altamente especializadas y su valor es incremental en función de sus características. Por otro lado, esta prueba no debería ser usada como prueba aislada para el diagnóstico de C. difficile, su mayor potencial es en su atributo de alta sensibilidad y valor predictivo negativo elevado (15). 

Como hacerlo mejor.

Definitivamente es muy complejo definir una mejor manera de diagnosticar con pruebas de laboratorio la infección por C. difficile, lo que sí puede quedar claro es que realizar una prueba de forma independiente puede llegar a ser considerado una mala práctica (incluso considerado por la Sociedad Europea de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas) y se requiere entender el contexto para darle la validez suficiente a la realización de pruebas complementarias en un algoritmo que cobije la suficiente sensibilidad para descartar adecuadamente a los individuos negativos y que logre entregar la suficiente información cuando el paciente esté positivo. Todo esto desde el contexto de oportunidad de respuesta, optimización de recursos y confianza en los resultados.

Considerando lo anterior, se puede concluir que la primera prueba debe tener un elevado valor predictivo negativo (alta sensibilidad), en ese campo están la GDH o la NAAT. Con esto logramos descartar la infección por C. difficile con un alto porcentaje de seguridad. Si la prueba es positiva se debe realizar una segunda prueba que tenga un alto valor predictivo positivo (con una especificidad alta), y en este grupo están por ejemplo los inmunoensayos enzimáticos para Toxina A y B. Si la segunda prueba genera un resultado negativo, se debería contemplar la posibilidad de baja presentar carga de toxina muy por debajo del límite de detección de estas pruebas o ser portadores de cepa toxigénica.

Si la primera prueba utilizada es GDH podemos usar una alternativa y es usar NAAT para identificar correctamente la presencia de cepa toxigénica.

Existe también una definición clínica importante y es evitar usar la prueba repetidamente en el paciente para evaluar curación ya que las esporas pueden seguir presentes en heces a pesar de haber controlado la microbiota intestinal. La prueba es de diagnóstico, no de control.

Existe un grupo variado de alternativas de algoritmos a usar, lo importante es identificar que la complementariedad de las pruebas permiten ejercer un servicio más completo y de mayor calidad si se usan adecuadamente. Sumado a ello está el tema educacional en los servicios de hospitalización para identificar el protocolo a usar y la correcta implementación de algoritmos que contribuyan a identificar de manera prioritaria los casos que se presenten y controlen de forma adecuada.

Es función de cada laboratorio identificar cómo mejorar este servicio, requiere tiempo, revisión de proveedores, productos y alternativas que cumplan con las necesidades del control de la enfermedad.

NOTAS:

1. Burke KE, Lamont JT. Clostridium difficile infection: a worldwide disease. Gut Liver. 2014 Jan;8(1):1-6. doi: 10.5009/gnl.2014.8.1.1. Epub 2014 Jan 13. PMID: 24516694; PMCID: PMC3916678.
2. Gateau C, Couturier J, Coia J, Barbut F. How to: diagnose infection caused by Clostridium difficile. Clin Microbiol Infect. 2018 May;24(5):463-468. doi: 10.1016/j.cmi.2017.12.005. Epub 2017 Dec 18. PMID: 29269092.
3. Edlund C, Nord CE. Effect of quinolones on intestinal ecology. Drugs 1999;58 Suppl 2:65-70.
4. Kelly CP, LaMont JT. Clostridium difficile: more difficult than ever. N Engl J Med 2008;359:1932-1940.
5. Pothoulakis C, Lamont JT. Microbes and microbial toxins: paradigms for microbial-mucosal interactions II. The integrated response of the intestine to Clostridium difficile toxins. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2001;280:G178-G183.
6. Brandt LJ. American Journal of Gastroenterology Lecture: intestinal microbiota and the role of fecal microbiota transplant (FMT) in treatment of C. difficile infection. Am J Gastroenterol 2013;108:177-185.
7. Bauer M.P. Kuijper E.J. van Dissel J.T. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID): treatment guidance document for Clostridium difficile infection (CDI). Clin Microbiol Infect. 2009; 15: 1067-1079.
8. Surawicz CM, Brandt LJ, Binion DG, et al. Guidelines for diagnosis, treatment, and prevention of Clostridium difficile infections. Am J Gastroenterol 2013;108:478-498.
9. Freeman J, Wilcox MH. The effects of storage conditions on viability of Clostridium difficile vegetative cells and spores and toxin activity in human faeces. J Clin Pathol 2003;56:126-8.
10. Frädrich, C.; Beer, L.-A.; Gerhard, R. Reactive Oxygen Species as Additional Determinants for Cytotoxicity of Clostridium difficile Toxins A and B. Toxins 2016, 8, 25. https://doi.org/10.3390/toxins8010025
11. Bartlett JG. How to identify the cause of antibiotic-associated diarrhea. J Crit Illn. 1994; 9: 1063-1067
12. Crobach MJ, Planche T, Eckert C, Barbut F, Terveer EM, Dekkers OM, Wilcox MH, Kuijper EJ. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: update of the diagnostic guidance document for Clostridium difficile infection. Clin Microbiol Infect. 2016 Aug;22 Suppl 4:S63-81. doi: 10.1016/j.cmi.2016.03.010. Epub 2016 Jul 25. PMID: 27460910.
13. Shetty N, Wren MWD, Coen PG. The role of glutamate dehydrogenase for the detection of Clostridium difficile in faecal samples: a meta-analysis. J Hosp Infect 2011;77:1-6.
14. George WL, Sutter VL, Citron D, Finegold SM. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol 1979;9:214e-9
15. O’Horo JC, Jones A, Sternke M, Harper C, Safdar N. Molecular techniques for diagnosis of Clostridium difficile infection: systematic review and meta-analysis. Mayo Clin Proc 2012;87:643-51.